石墨烯是一种由碳原子以sp2杂化轨道组成的六边形呈蜂巢状排列的二维碳纳米材料 ^［ 1 ］ 。英国曼彻斯特大学物理学家Andre Geim和Константин Новосёлов通过机械剥离法成功从石墨中分离出石墨烯而获得2010年诺贝尔物理学奖。过去，石墨烯因为其优异的机械、导电、光学特性，被广泛应用于电子和化学领域。从氧化石墨中提取出的氧化石墨烯独特的理化性质被认为是一种很有前景的可应用于生物医学领域的材料。与石墨烯相比，氧化石墨烯具有含氧官能团，可以修饰石墨烯的化学性质，例如增加其亲水性（羟基、羧基等）等。近年来，石墨烯及其衍生物在生物医学领域的应用越来越广泛 ^［ 2 ］ ，例如生物传感器 ^［ 3 ］ （作为眼科电生理检查的电极）、组织工程 ^{［ 4 , 5 ］} （作为人工角膜的材料）、图像传感器 ^［ 6 ］ （例如人工视网膜）、基因转染 ^{［ 7 , 8 ］} 、药物递送系统 ^{［ 9 , 10 , 11 ］} （作为治疗脉络膜黑色素瘤靶向药的递送系统、递送抗血管内皮生长因子药物治疗年龄相关性黄斑变性等）、癌症治疗 ^［ 12 ］ 、细胞培养 ^{［ 13 , 14 ］} 等。目前越来越多的研究表明石墨烯及其衍生物是良好的作为细胞培养基板的纳米平台，可以促进胚胎干细胞、神经干细胞（neural stem cells，NSC）、间充质干细胞等多能细胞的黏附、增殖、分化等 ^［ 15 ］ 。在过去，神经退行性疾病一直是医疗界的难题，近年来NSC移植有望为治疗神经退行性疾病提供新的方法 ^［ 16 ］ ，因此对NSC的调控就显得尤为重要。因此，本文将着重阐述石墨烯及其衍生物对NSC增殖分化的影响。

一、石墨烯和氧化石墨烯的制备

1.石墨烯：最早的方法是通过透明胶带从石墨结晶机械剥离出石墨烯，这种方法可以剥离出高质量的石墨烯，但是不适合大规模合成 ^［ 17 ］ 。其他的方法还有化学剥离法 ^［ 18 ］ 、外延石墨烯生长法、化学气相沉积法 ^{［ 19 , 20 ］} 和直接有机合成法 ^［ 21 ］ 。其中，化学气相沉积法在大规模高质量生产上最有优势，可以大规模制备石墨烯 ^［ 22 ］ 。

2.氧化石墨烯：目前最广泛使用的氧化石墨烯制作方法是Hummers法：先通过高锰酸钾和硫酸对石墨进行氧化，从而获得氧化石墨作为提取原料，然后通过声波降解法在溶剂中提取氧化石墨烯 ^［ 18 ］ 。氧化石墨烯制备方法简单、成本低廉、转移途径高效（可以旋涂或喷涂到几乎任何基板表面，例如可以包被在角膜接触镜表面，有降低电磁干扰、减少水分蒸发等作用 ^［ 23 ］ ），并且具有独特的物理化学特性（良好的导电性以及扩展性、携带官能团（羟基等）的能力、可调节的微观拓扑结构等），因此在生物医学领域的应用越来越广泛。

二、石墨烯及其衍生物对NSC黏附和增殖的影响

       细胞生存的微环境可以显著影响细胞的行为。微米级的材料和细胞大小相当，可以影响细胞级单位的活动，对整个细胞产生接触引导作用。早在1911年，接触引导现象就已被观察到 ^［ 24 ］ ，并在随后得到了证实 ^［ 25 ］ 。而比微米尺度低几个数量级的纳米材料对细胞的影响更为复杂，纳米材料的尺寸和各种细胞受体相当，可能会影响受体介导的通路而影响细胞，进而影响细胞的黏附 ^［ 26 ］ 。细胞表面的丝状伪足可以感知它周围的纳米拓扑结构，从而受到纳米材料的影响，这也是纳米材料影响细胞活动的基础。Kim等 ^［ 27 ］ 通过用氧化石墨烯纳米颗粒对人胚胎NSC进行干预，发现5 μg/ml的氧化石墨烯不但没有细胞毒性，还能够加强细胞间和细胞与培养基板间的相互作用，并增加E钙黏蛋白和N钙黏蛋白的表达，这两种蛋白都和细胞黏附相关。此研究是以带羧基（-COOH）的氧化石墨烯为基础的，与传统石墨烯相比，氧化石墨烯所带有的官能团赋予了其更有利于细胞生长的物化性质，例如亲水基团［羧基（-COOH）、羟基（-OH）］加强了材料的亲水性，可以通过静电相互作用加强培养液中血清蛋白的吸收 ^［ 28 ］ 。Ma等 ^［ 29 ］ 探究了软硬不同的两种三维石墨烯支架对小鼠NSC的影响，发现与较软的材料相比，较硬的材料上培养的细胞对黏着斑蛋白（vinculin）和整合素（intergrins）的表达提高，前者是和局部黏附有关的有促进增殖作用的细胞骨架蛋白，后者是和细胞与基板连接有关的跨膜受体，这两者的表达上调证明较硬的石墨烯支架可以更好地促进细胞的黏附和增殖。Fang等 ^［ 30 ］ 发现当NSC生长在三维石墨烯支架上时，Ki67表达明显提高，并且通过代谢组学的方法证明了三维石墨烯支架促进了NSC的增殖。因此，通过修饰官能团和调整空间结构等方法可以促进NSC黏附和增殖。

三、石墨烯及其衍生物对NSC分化的调控

1.微观拓扑结构对分化的影响：培养基板的微观拓扑结构可以影响细胞分化的方向。早在1999年，Flemming等 ^［ 31 ］ 指出培养板的微观拓扑结构（如凹槽等）可对细胞产生影响。2007年，Yim等 ^［ 32 ］ 用合成的线性排列的纳米材料增强了间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）向神经元的分化，说明干细胞受所生长的微观环境的调控。由于神经元接近于线性结构，因此线性排列的拓扑结构有利于干细胞向神经元的分化。2012年，Wang等 ^［ 33 ］ 证实了线性排列的氟化石墨烯可以促进间充质干细胞分化为神经元。通过静电纺丝的方法，Qing等 ^［ 34 ］ 将热还原的氧化石墨烯分别包被到随机排列和线性排列的丝素表面，以研究SH-SY5Y（人神经母细胞瘤细胞）细胞的生长情况。研究发现，与随机排列组相比，线性排列组的细胞有明显的线性生长的特性，种子细胞分化为神经元的比例显著升高；且与普通的细胞培养板相比，线性排列组的细胞分化为神经元的比例更高且轴突更长。Yang等 ^［ 35 ］ 通过光蚀刻法制作宽度不同的石墨烯氧化物凹槽来研究其对NSC的影响，结果表明：当凹槽宽度为5 μm时，石墨烯氧化物对细胞增殖和分化为神经元的促进最佳。因此微观拓扑结构对NSC分化的影响十分显著，无论是微凹槽拓扑结构、线性排列拓扑结构、或者添加线性屏障，都能促进NSC向神经元的分化，而石墨烯及其衍生物则可以通过各种方法实现这一目标。

2.石墨烯衍生物的导电性对分化的影响：与传统导电材料相比，石墨烯衍生物具有更好的导电性，这一特性对神经源性细胞具有独特的影响。近年来已经有研究表明，对NSC进行额外的电刺激可以促进其增殖、迁移和分化 ^{［ 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 ］} 。Yan等 ^［ 42 ］ 在聚吡咯-石墨烯复合线性纳米材料上培养小鼠神经节细胞并施以电刺激，与对照组相比，观察到经过电刺激的神经节细胞轴突变长，且浓度在6%最合适，同时证明了电刺激和线性排列这两个因素都可促进轴突伸长，且没有显著的细胞毒性。青光眼的病理改变主要为视网膜神经纤维层的萎缩，而神经纤维层正是由神经节细胞的轴突组成。具有良好导电性和线型排列的石墨烯衍生物，可为今后中晚期青光眼的治疗提供一定的思路。Guo等 ^［ 43 ］ 发现石墨烯可以通过影响细胞膜的动作电位和静息电位（静息状态时超极化，可以上调TREK-1通道，提高产生动作电位的概率）来加速NSC和其子细胞的成熟，说明除电刺激之外，就其本身的导电性而言，石墨烯是一种适合神经细胞生长的基板。Fu等 ^［ 44 ］ 证明了左旋乳酸/氧化石墨烯复合膜和电刺激都可以促进NSC向神经元分化并且促进神经元轴突的延长。

3.石墨烯及其衍生物的弹力模量对NSC分化的影响：2006年，Engler等 ^［ 45 ］ 发现细胞生存基板的弹性模量能影响干细胞的分化方向：首先，在分子层面，细胞内需要一个“机械传感器”，它能将细胞与基板的相互作用力生成一个信号作用在细胞内，而非肌源性肌球蛋白Ⅱ亚型家族就是这个“机械传感器”。在此理论基础之上，Engler等将间充质干细胞分别培养在弹性模量为0.1~1（接近大脑）、8~17（接近横纹肌）、25~40 kPa（接近类骨质的交联胶原）的3种基板上，在上述3种材料上间充质干细胞分别分化为神经组织性细胞、肌源性细胞、成骨性细胞，并且细胞形态、相关RNA检测结果、免疫荧光染色相互印证，这种特异性的分化比添加诱导成分的选择性更强，而如果抑制了非肌源性肌球蛋白Ⅱ亚型家族的ATP酶活性，这种选择性分化将不复存在。不仅如此，研究还发现，在更硬的材料上培养的间充质干细胞局部黏附相关的成分（细丝蛋白、黏着斑激酶、络氨酸激酶等）的表达也随之提高，并且其中非肌源性肌球蛋白Ⅱ亚型家族的活性也更强，正是此类蛋白活性的提高促进了细胞的黏附，这也印证了前文所提到的更硬的材料促进细胞黏附的结论。而由于石墨烯衍生物纳米材料的独特性质，弹力模量可以通过修饰进行调整，Ma等 ^［ 29 ］ 通过用软硬两种弹性模量的三维石墨烯材料培养NSC，发现在较硬的石墨烯材料上细胞的黏附、生长上有一定优势；在分化方面，硬石墨烯支架容易促使NSC分化为星形胶质细胞，而软石墨烯支架更容易促进NSC分化为神经元。Guo等 ^［ 46 ］ 通过将细菌培养在三维石墨烯支架上得到三维细菌源性纤维素/石墨烯复合体，这种复合物的弹力模量更接近软组织，在相同的分化条件下，生长在该支架上的NSC更容易分化成神经元且形成的轴突更长。

       近年来，石墨烯及其衍生物因为其独特的物化性质，成为了生物医学界的“新宠”，它可以通过促进黏附、促进向神经元的定向分化来影响NSC的命运，从而为治疗神经退行性疾病提供了新的前景和方向。但是，目前大部分研究都还停留在体外阶段，如何将其应用在临床疾病的治疗上仍是一个难题。石墨烯材料在眼科的多个方向已实现临床应用，如角膜接触镜、人工角膜、脉络膜黑色素瘤、人工视网膜等，但是石墨烯对干细胞的调控在眼科领域还缺少研究。石墨烯对NSC命运的调控为青光眼等不可逆视神经萎缩疾病提供了治疗和研究的方向；相信通过特定设计的石墨烯材料对视网膜祖细胞和角膜缘干细胞等的分化在未来也能进行定向调控。最后，希望通过本文为眼科相关干细胞分化的调控和相关疾病的治疗获取新思路提供帮助。